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Science子刊:在家就可快速准确地检测唾液中的新冠病毒及其变体

来源: 更新时间:2022-12-02 21:20:27
The Beginning

随着SARS-CoV-2 Delta变体(B.1.617.2)对未接种疫苗的人群造成破坏,以及COVID-19病例在世界各地激增,这种大流行病远未结束。尽管在过去一年半里SARS-CoV-2诊断测试的发展速度令人印象深刻,但绝大多数患者的样品仍然必须被送到实验室进行处理,这拖慢了COVID-19病例追踪的速度。如果要检测样品中的特定SARS-CoV-2变体,就必须对其进行基因测序,这需要更多的时间和资源。

如今,在一项新的研究中,来自美国哈佛大学威斯生物启发工程研究所、麻省理工学院和波士顿地区几家医院的研究人员开发出一种廉价的、基于CRISPR的诊断测试,允许用户在家里使用唾液样品对自己进行SARS-CoV-2及其多种病毒变体的测试,而不需要额外的仪器。相关研究结果发表在2021年8月6日的Science Advances期刊上,论文标题为“Minimally instrumented SHERLOCK (miSHERLOCK) for CRISPR-based point-of-care diagnosis of SARS-CoV-2 and emerging variants”。

Science子刊:在家就可快速准确地检测唾液中的新冠病毒及其变体

这种称为Minimally Instrumented SHERLOCK(miSHERLOCK)的诊断设备易于使用,提供的结果可在一小时内由配套的智能手机应用程序读取和验证。它在实验中成功区分了SARS-CoV-2的三种不同变体,并且可以迅速重新配置以检测更多的变体,如Delta变体。该设备可以用三维打印机和常见的部件组装,价格约为15美元,重复使用这些部件使单个检测的成本降至6美元。

论文共同第一作者、哈佛大学威斯生物启发工程研究所和麻省理工学院的博士后研究员Helena de Puig说,“miSHERLOCK消除了将患者样品运送到集中测试地点的需要,并大大简化了样品制备步骤,使患者和医生能更快、更准确地了解个人和社区的健康状况,这在不断发展的大流行病中至关重要。”

从供应链到SHERLOCK

作为波士顿儿童医院专门研究传染病的儿科讲师,论文共同第一作者Rose Lee博士已在COVID-19大流行病的前线工作了一年多。她在诊所的经历为最终开发miSHERLOCK的项目提供了灵感。

Lee说,“以前在医院里随处可见的一些简单的东西,比如鼻咽拭子,突然变得难以获得,因此常规的样品处理程序被打乱了,这在流行病背景下是一个大问题。我们团队开展这个项目的动机是为了消除这些瓶颈,在不太依赖全球供应链的情况下为COVID-19提供准确的诊断方法,并且还可以准确地检测开始出现的病毒变体。”

对于他们诊断设备的SARS-CoV-2检测部分,这些作者选择了论文通讯作者、哈佛大学威斯生物启发工程研究所核心教员Jim Collins博士的实验室构建的基于CRISPR的技术,称为SHERLOCK(specific high sensitivity enzymatic reporter unlocking)。SHERLOCK利用CRISPR的“分子剪刀”在特定的位点切割DNA或RNA,这还有一个额外的好处:这种特定类型的分子剪刀也会切割周围区域的其他DNA片段,使其能够切割携带荧光信号的单链核酸探针分子,从而产生表明靶标已被成功切割的荧光信号。

该诊断程序只需要用户将口水(唾液)吐进样品制备室,然后将收集盘转移到反应室,并按下柱塞,从而激活反应,并将交叉污染的风险降到最低。图片来自Science Advances, 2021, doi:10.1126/sciadv.abh2944。

这些作者创建了一种SHERLOCK检测,旨在切割SARS-CoV-2的核蛋白(nucleoprotein, NP)编码基因的特定区域,该特定区域在该病毒的多个变体中是保守的。当这种称为Cas12a的分子剪刀成功地结合并切割NP基因时,附近的单链DNA探针也被切割,从而产生荧光信号。他们还创建了额外的SHERLOCK检测,旨在靶向刺突蛋白(S蛋白)序列中的一组病毒突变,这些突变代表了三种SARS-CoV-2病毒变体:Alpha、Beta和Gamma。

有了能够可靠地在美国食品药品管理局(FDA)授权的诊断测试的可接受浓度范围内检测病毒RNA的检测方法,这些作者接下来集中精力解决诊断中可能最困难的挑战:样品制备。

吐口水、等待、扫描

论文共同第一作者、哈佛大学威斯生物启发工程研究所临床研究员Xiao Tan博士说,“当你测试样品中的核酸[如DNA或RNA]时,你需要做很多步骤来制备样品,以便你能真正提取和扩增这些核酸。你必须在样品运送到检测机构的过程中保护它,而且如果你处理的是可传播的疾病,还要确保它不具有传染性。为了使它成为一种真正易于使用的诊断测试,我们必须尽可能地简化它。”

这些作者选择使用唾液而不是鼻咽拭子样品作为他们的收集方法,因为用户更容易收集唾液,而且已有研究表明SARS-CoV-2在感染后的更多天内可在唾液中检测出来。但是未经处理的唾液也带来了自身的挑战:它含有降解各种分子的酶,产生的假阳性率很高。

这些作者开发了一种新技术来解决这个问题。首先,他们在唾液中加入了两种名为DTT和EGTA的化学物质,并将样品加热到95°C 3分钟,这就消除了未经处理的唾液中的假阳性信号,并裂开任何病毒颗粒。然后他们加入了一种多孔膜以便在其表面捕获RNA,最后可以直接加入到SHERLOCK反应中以产生检测结果。

为了将唾液样品制备和SHERLOCK反应整合到一种诊断设备中,这些作者设计了一种简单的电池供电设备,有两个腔室:一个加热的样品制备室和一个不加热的反应室。用户向样品制备室吐口水(唾液),对它进行加热,等待三至六分钟,唾液就会进入过滤器。用户取出过滤器并将其转移到反应室的柱子上,然后按下柱塞,将过滤器放入反应室,并刺穿蓄水池,以激活SHERLOCK反应。55分钟后,用户通过有色透光器窗口观察反应室,确认是否存在荧光信号。他们还可以使用一种配套的智能手机应用程序,分析智能手机摄像头记录的像素,从而提供明确的阳性或阴性诊断结果。

这些作者用27名COVID-19患者和21名健康患者的临床唾液样品测试了他们的诊断设备,发现miSHERLOCK在96%的时间里能正确识别COVID-19阳性患者,在95%的时间里能正确识别无该疾病的患者。他们还通过将含有代表每种病毒变体的突变的全长合成病毒RNA加入健康人的唾液中,测试了这种诊断设备检测SARS-CoV-2 Alpha、Beta和Gamma SARS-CoV-2变体的性能,并发现该设备在各种病毒RNA浓度下都有效。

论文共同第一作者、Collins实验室研究助理Devora Najjar说,“miSHERLOCK的优点之一是它是完全模块化的。该设备本身与检测方法是分开的,因此你可以整入不同的检测方法来检测你想要检测的特定RNA或DNA序列。该设备的成本约为15美元,但大规模生产将使之降至约3美元。可以在大约两周内建立新靶点的检测方法,从而能够快速开发针对COVID-19和其他疾病的新变体检测方法。”

为现实应用做好准备

这些作者在构建他们的诊断设备时考虑到了低资源环境,因为这种大流行病让人们看到了世界不同地区之间在医疗服务方面存在的巨大不平等现象。该设备的组件可以由任何能够使用三维打印机的人制造,相关的资料文件和电路设计都可以在网上公开获得。增加一种智能手机应用程序也是针对资源有限的环境,因为移动电话服务几乎在世界任何地方都可以使用,甚至在步行难以到达的地区。他们渴望与那些有兴趣大规模生产miSHERLOCK以进行全球分销的制造商合作。

Collins说,“当miSHERLOCK项目开始时,几乎没有进行SARS-CoV-2变体监测。我们知道,在评估COVID-19对当地和全球社区的长期影响时,这种病毒变体跟踪将是非常重要的,所以我们推动自己构建一种真正分散管理的、灵活的、用户友好的诊断平台。通过解决样品制备问题,我们已经确保这种设备实际上准备好供消费者使用,我们很高兴与工业伙伴合作,使其商业化。”

哈佛大学威斯生物启发工程研究所创始主任Don Ingber博士说,“通过将前沿生物技术与低成本材料相结合,这个研究团队构建出一种强大的诊断设备,可以由没有高级医学学位的人在当地制造和使用。这是一个完美的例子,说明了哈佛大学威斯生物启发工程研究所的使命:将改变生活的创新交到需要它们的人手中。”(生物谷 Bioon.com)

参考资料:

Helena de Puig et al.Minimally instrumented SHERLOCK (miSHERLOCK) for CRISPR-based point-of-care diagnosis of SARS-CoV-2 and emerging variants. Science Advances, 2021, doi:10.1126/sciadv.abh2944.

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